【论文精选】当归甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及组织稳定性分析
《河南农业大学学报》2018年第52卷第6期刊载了甘肃中医药大学药学院以及甘肃中医药大学科研实验中心的杨雪，雒军，杨彩霞，王振恒，夏琦，王引权的论文——“当归甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及组织稳定性分析”。该研究由国家重点研发计划专项“中药材生态种植技术研究及应用”项目（2017YFC1700705）、国家自然科学基金项目（81660625）、甘肃省高校协同创新科技团队支持计划（2016C-05FF09）资助。责任编辑曾庆东。
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糖酵解是生物体中葡萄糖分解产生能量的共同代谢途径。甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH是糖酵解、糖异生及卡尔文循环途径中的关键酶。当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels为伞形科多年生草本植物，具有活血补血、调经止痛、润肠通便等功效。当归多糖代谢过程复杂，GAPDH是当归多糖生物合成中的关键酶，在生物进化系统中具有广泛而高度的保守性，因此GAPDH基因经常作为基因表达量研究中的内参照基因。
此外，GAPDH基因通过抑制活性氧积累、DNA修复、信号传导、多种修饰作用及膜的定位运输参与多种亚细胞水平活动，具有抵抗高温、盐碱、干旱胁迫的功能，是一种重要的抗逆境胁迫基因。
本研究采用逆转录PCR、同源克隆及cDNA末端快速克隆RACE等技术从当归中克隆得到1个GAPDH基因AsGAPDH的全长cDNA序列，利用生物信息学手段对其编码蛋白的结构与功能进行预测和分析，借助qRT-PCR检测AsGAPDH基因在当归不同组织中的转录水平，分析其在逆境胁迫条件下表达模式，验证其与当归多糖积累的相关性以及作为内参基因使用的稳定性。
当归植株于2017年叶盛期采自甘肃岷县。大肠杆菌DH5α为甘肃中医药大学中药免疫与分子生物学实验室保存。提取当归根、叶柄、叶片的总RNA。测定RNA的纯度及浓度，检测RNA的完整性，进行cDNA合成。
通过对GenBank中GAPDH基因CDS序列进行同源比对，找出高度保守序列，设计简并引物F和R。以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物检测回收纯化目的片段，连接至pGEM-T Easy vector，热击法转化大肠杆菌感受态细胞，抗性平板筛选阳性单克隆，菌落PCR鉴定后测序。测序结果去除载体序列后得到目的基因序列，在NCBI网站上进行Blast搜索，并利用DNAMAN软件进行多重比对。采用RACE扩增 AsGAPDH基因的末端，克隆AsGAPDH基因全长cDNA。
对AsGAPDH基因进行生物信息学分析。以NCBI的ORF Finder寻找基因开放阅读框；采用NCBI的BLAST功能进行核苷酸及氨基酸序列的同源搜索，获得同源物种的氨基酸序列后，利用DNAMAN软件进行多重比对，以MEGA5.0软件中的邻位归并法做聚类分析并构建系统进化树。采用SignalP软件预测信号肽；用ExPASy在线服务器的ProtParam和ProtScale分析AsGAPDH蛋白的基本性质；TMHMM server v.2.0分析该蛋白的跨膜结构区域分布情况；在NCBI的CDD数据库中搜寻保守结构域；分别利用PBIL和Phyre2在线工具预测当归GAPDH的二级结构，建立三维空间模型。
对AsGAPDH基因实时荧光定量PCR分析的表达分析，利用delta Ct 法比较AsGAPDH基因在当归不同组织的Ct值变化。结果表明，克隆得到当归GAPDH基因cDNA全长序列为1 345 个核苷酸，开放阅读框ORF为1 005 bp，3’ UTR和5’UTR长度分别为268 bp和72 bp，共编码334个氨基酸，该基因命名为AsGAPDH。AsGAPDH基因编码蛋白的预测相对分子质量为36.3 kD，理论等电点为7.06，为亲水性非分泌型蛋白，与伞形科植物白芹的亲缘关系最近。AsGAPDH基因在当归根、叶柄及叶中的表达量相近且稳定性好，扩增特异性强。
通信作者：
王引权，甘肃中医药大学药学院教授，博士，硕士生导师，中药学学术带头人，主要从事药用植物栽培生理、植物营养和中药材质量综合评价研究。现为甘肃省“333科技人才工程”第一、二层次人选，甘肃省领军人才第二层次人选。主持完成国家省部级各类科研项目12项，其中获甘肃省科技进步三等奖2项，甘肃省农业丰收一等奖1项，甘肃农垦科技进步一等奖3项，二等奖4项，三等奖2项。获国家专利2项。在国内外发表学术论文20多篇，其中被SCI收录1篇。参编专著3部。
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